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结核分枝杆菌毒力基因mce1a侵袭性机制研究及微生物16S rDNAs快速分类共鉴定

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内容提示: 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名:薛利军签字日期:2006年5月18日落蕃、第.学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阆。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有...

文档格式:PDF| 浏览次数:14| 上传日期:2015-06-24 20:32:36| 文档星级:
独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名:薛利军签字日期:2006年5月18日落蕃、第.学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阆。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名:薛利军导师签名:戚中田薪训莩签字日期:2006年5月18日签字日期:2006年5月18日A小双薄 第二军医大学博士学位论文英文缩写A.M LⅣAm DAPbpBCf PBCG0-ⅣfECdc42CFUCRCtddH ,OD EPCD M EMD M SOdN TPdsRN AD TTEBED TAEG FPn)FQ —PCRG APD HG STIgGIPTGl RAK.1kD aLAMLBIpLPSLRR英文缩略词表Abbrevi ati ons英文全称avi anM ol oneyl euk哪i a vi rusm pi ci l l i naIkaIi nephosphatasebasepai r2,5.brom o_4一chIor0—3· fndoJ yi phosphatebaci l l us Cal m ette.G u6ri np· m erc印toem al l olcel l di Vi si oncycl e 42( G TPbi ndtng protei n)cl onal fonnati on。uni tcom pl em emreceptorm reshol dcycl edoubl e di sti l l ed H ,Odi et}l yI pym carbonateDul becco’ s m odm edeagl em edi adi m etl l yl sul phoxi dedeoxynucl eoti de订i phosphatedoubl e stranded RN Adi thi O 也ren0Iethi di umbrom i deethyl ene di am i ne tetraacerti c aci denhancedFeen玎uO rescence protei nfi l {podi umreal 一恤ne nuorescencequanti tatx 第二军医大学博士学位论支中文摘要近年,结核分枝柑‘ 茵( A和co妇c旭,f"Ⅲf“ 6e,c“ ,Ds括,M tb) 感染所致结核病( tubercuIosi s,TB) 的发病率和死亡率一直高居不下。在全球,M tb感染者几占总人口的二分之一,每年TB新发和死L二患者分别在900万和200万人左右。在中国,TB( 主要是肺结核) 现有患者约500万人( 80%在农村) ,数量居世界第二位,其发病数与死亡数一直高居法定报告甲乙类传染病的首位。目前,传统卡介莳的预防效果已小甚理想,并且耐药M tb感染正逐渐增多。然而,M tb的具体致病机制仍不十分清楚,这为研发新型疫苗和更加敏感有效的抗TB药物造成了很大障碍。本研究立足于M tb侵袭相关基因m cPl a,首先,探讨了该基因在M l b潜伏生存与活性增殖状态下的表达特性,并对其全长和截短序列分别进行了克隆、原核表达及纯化。其次,设计、转录合成了两条肼cel a特异性小干扰瑚qAs( sm au i Ⅱterferi ng RN As,si RN As) ,并通过H EK293.T细胞,对si RN As的抑制活性与抑制效率进行了鉴定。在上述工作基础上,进一步通过小鼠巨噬细胞RAw2647和人结肠癌上皮细胞cT 26.cL25,进行了T二M cel A蛋白的细胞刺激实验、m cel a特异性si RN A的体外干扰实验以及重组EcoH( 表达完整M cel A蛋白) 的体外侵袭实验,着重探讨了M cel A蛋白介导细菌侵袭的作用机制。此外,本研究还通过对多种微生物16s rDN As的序列比对与进化树分析,分别设计、合成了细菌通用及特异性引物,建立了实时荧光定量PcR( real —Ii m efl uorescen∞曰uantnati ve PCR,FO .PcR) 快速分类与检测方法。一、毒力基因Ⅲ∞l a在M tb潜伏生存与活性增殖状态下的表达特性M cb属专性需氧细胞内寄生菌,感染后能在宿主体内以休眠状态长期潜伏生存,并在一定条件下复苏、大量增殖从而引发疾病。鉴于M 砧在低于25℃时停止生长,故低温条件下长时间存活的M fb菌株可以作为一种非增殖状态的体外模型。本研究选取两种标准株( 强毒株H 37Rv和弱毒株H 37Ra) 及八种』临床分离株( 非耐药四株,耐利福平或异烟肼各两株) ,分别以4℃保存3 m 与37℃培养2 w ~5 w 为其潜伏生存和活性增殖状态。通过溶菌酶、蛋白酶K及l %sDs裂解M tb,提取、纯化总RN A,井以不含RN ∞e的DN ase消化去除DN A。设计、合成m ∞1a特异性引物,以看家基因16s rRN A为平行参照,通过R1:PcR分别检测上述样品m cPl a的表达。结果显示,处于非增殖期的十种M tb菌株,Ⅲ∞1a基因均未见表达;而处于活性增殖期的上述菌株,,w Pl a基因均有稳定表达,且在4i 同菌株的表达水平相似。上述结果初步提示,m ∞1a基因的表达可能与M tb侵袭力或潜伏生存能力有关。二、M cel A蛋白介导细菌侵袭的作用机制首先,进行了全长与截短m cPl a基因的克隆及原核表达。设计Exo-州m er、In-pri m er及In.两m er2共三对引物,通过巢式PcR,分别扩增M tb(H 37Rv)全长与截短的ⅢcPl a基因一一m ∞1a和T_Ⅲ∞l a,并将其克隆至6× 礤s原核表达载体pRoEx—H Tb和热诱导表达载体pBV220,分别通过IPTG 或42℃加热诱导目的基因pRO Ex—H Tb和热诱导表达载体pBV220,分别通过IPTG 或42℃加热诱导目的基因 第二军医大学博士学位论文的表达,并进行N i .N TA柱纯化或分子筛纯化。对菌体样品和纯化样品分别进行sDs.PAG E分析,并对pRO Ex.m cel a菌体样品及纯化产物,以抗6× H i s M Ab进行w estembl ot鉴定。结果显示,( i ) 对pRO Ex。m cel a和pBv_1、m cel a转化菌,分别在约45 KD a和27KDa处有目的蛋白条带,与预期分子量基本一致;完整的M cel A蛋白( 含N 端信号肽) 以非可溶性表达,且可能稳固表达于细菌细胞壁或细胞膜;截短的T-M cel A蛋白( 为活性部分,不含N 端信号肽) 则主要以包涵体形式表达,部分( 约1,3) 以可溶性表达,侧面反映了N 端疏水性信号序列对M cel A定位的影响。( i i )经N i .N TA柱纯化或包涵体变性、复性及分子筛纯化,均可获得相应分子量的目的蛋白,但M cel A因其膜表达特性导致表达量及纯化得率均较低,T-M cel A则因表达量高( 菌体总蛋白的20%) 而有较高得率与纯度。其次,进行了特异性血IⅢAs的设计、转录合成,以及在H EK 293.T细胞内靶向研cPl a的干扰实验。为便于检测,将全长m cel a克隆至增强型绿色荧光蛋白( eIl l l anced目eennuorescencepm tei n,EG FP) 基因的上游,构建表达M cel A.EG FP融合蛋白的真核质粒pEG FPN l .m cel a。以在线软件“ si RN AT缸get Fi nder” 及“ BLAsT” 设计、筛选靶向m cPl a的si RN As模板,通过T7体外转录试剂盒,合成si 312( 特异性) 、si 410( 特异性) 、si EG FP( 阳性对照) 和si m R( 阴性对照) 等si RN As。应用脂质体,将pEGFPN l .m cel a质粒或分别与2.0¨ l 各si RN As(约1.5衄ol ,“ 1)共转染HEK293.T细胞,通过荧光显微镜、半定量RT-PCR及w j stembl ot,对特异性si l w As的抑制活性进行初步鉴定。进一步,将各si RN As分多个剂量梯度共转染,并通过荧光显微镜、流式细胞术、F0一PCR及w j stembl ot,对si RN As的抑制活性与抑制效率进行了检测。结果显示,( i ) 通过T7 RN A聚合酶体外转录的方法,在24h内能大量获得长度为21bD的特定si IⅢAs;通过脂质体共转染,可实现si RN As向靶细胞内的高效递呈:并且,}玎! K 293.T能高效表达m 卯1a基因,可作为相关研究的理想细胞株。( i i ) 在转录水平,si 410和si 312对聊cPl a m RN A的抑制效率达90%和88%,均接近si EG FP( 92%) ;在翻译水平,si 410和si 312对M cel A蛋白的抑制效率达51%和49%,略低于si EG FP( 70%) 。( i i i ) w estembl ot显示,在约85 kDa处呈现两条紧密条带,推测M cel A—EG FP在H EK293.T细胞内表达时,部分融合蛋白可能会发生糖基化修饰。( i v) 上述结果还提示,靶向相同基因的不同si I斟As,其达到相同抑制效率的起效时间有所不同,推测可能与不同si RN As参与形成的RJ sc复合物切割靶m RN A效率不同有关。再次,在上述研究基础上,探讨了M cel A蛋白介导细菌侵袭的作用机制。x 堑三差垦垄兰堡主! 堡笙墨that expressi on of m cPl am i ghtberel ated晰th the i nvasi onandl atencyabi l i ti es ofM tb.2.M echani smof M cel Apm tei ni Ⅱvol ved i n bacteri al i nvasi onFi rstl y,the ful l 一l eng也andtm ncated m cPl agenesw ere cl oned andexprcssedi n EcD,fD H 5Q .After tl l reepai rsof PCRp血ners i ncl um ng Exo—pri m er,In-pri m er,and In-pri m er 2,、veredesi gnedand syl l m esi zed,t11e fLl l l —1engm (m cPl a)a11dtnm catedm cel a( T-州c口l a)genes w erc锄pl m edby nest-PCR,aIl d i Il sertcd i nto也eprokaryoti c expressi onVectorspRO Ex-H Tb、) l ri m6× H i s tag a11d pBV220 i n“ cedthm u曲heati ng.Target protei nsw erei nduced toexpressi ncorrespondi ngrecom bi namEco,fbyI PTG orheati ngto42℃,a11dpurm ed by the N i - N TA col um n or m ol ecul ar si eve.Then,ba曲eri all ysatesa11dpuri fi edfrom recom bi nantproducts( pRO EX—m cel a) w ere anal yzed by w bstem bl otfol l ow s.w eresubj ectedtosD s—PAG E,ands锄pl esw i th m e anti -6× H i s M Ab.Resul tsEco“dem onstratedpBv- Tm cel a,expressedan about 45 or 27 kD aprotei ni n accordal l ce耐也thepredi ctcdm ol ecul ar w ei ght( M w ) ,respecti vel yThe i ntact M cel Apm tei n com ai ni ngNtcH ni nalsi gnal p印ti de expressedi n non-sol ubl e f0肌,andm i ghtm em brane.The tnm cated T- M cel Aprotci ncoI曲i ni ngnosi gnal pepti de expressed m ai l l l yi n也e i ncl usi onbody forIn,姐d p删yi n sol ubkfo蛐(about one“ rd),w hi chrenectcdthat NterIIl i nal si 驴al sequencei nnuences t11e l ocati on of M cel A.( i i ) After puri fi c砒i onsby N i - N TAcol um nor m ol ecul arsi eve,both伽苫et pm tei ns埘thconect M W w ereacqui red.H ow ever’M cel Aw as of l owyi el dbecauseofi tsm em bral l el ocati on,a11d T_M cel A、vas ofas( i ) Therecom b血antEcD 疗contai ned pRO Ex—m cel aor10catestabl yon the cel l w al lorrel ati vel y hi gh yi el d(about20%of w b01e bacteri al protei ns).secondl y,m cBl a-speci 丘c si RN As、vcredesi gned,transcri bed,and subj ectedto m ei nterferenceexpe血nentsi n H EK293- T cel l s.For the convem ence of detecti O n,,押卯1aw ascl oned to theups仃eamofenhanced伊eennuorcscenceprotem ( EG FP) geneto constm ct ael l karyoti c pEG FPN l - m cel a pl踟idw hi chexpressesM cel A—EG FP m si onprotei n.Afterdesi 印i ngaIl dscreeni ngof si RN Atem pl ates throu曲onl i nesof tw ares“ si RN ArI魂etsi 312 andsi 410,andtl l econtrol si EG FP and si IRR w eresyrl tl 他si zed也rou曲the T7加vf阳衄scriptionki t.W eco—transfcctedpEG FPN l 一m cel aanddi frcrcmsi RN As( 2.0pl ,1.511IIl ol /“ I)i nH EK293一Tcel l s讪thlipofb咖ine,and deteⅡni ned m e i Il l l i bi ti ve acti vi ty of speci fi c si RN As tl l roughnuoresccncem i cm scopy,sem i -quanti tati ve RT_PCR,aIl d W estembl ot.Then,di Ⅱ’ erentsi RN As w ere co-tr趾sfected,w i 恤v撕ousdosage gradi em s,aIl dthei rsi l enci nge疏cts aIl de伍ci enci es w ere detected by nuorescencem i croscopy,now cytom etry,FQ —PCRw estem bl ot. Resul ts show edasfol l ow s.(i )Ittl l rough the加vf加transcri 埘onm e廿l odbyT7 RN Apol ym erase.Thesi RN As c趾bee伍ci em l ydel i Veredto伽苫ctl i pofectanl i ne.H EK293- T cel l sexpress M cel A at hi 曲1evel a11d can be chose as the i dealFi nder” and“ BLAST” ,m cPl a- speci fi cposi ti 、,eandnegati veaIl di s m pi dand conveⅡi cnttosyn血esi zesi RN As、Ⅳi th 21 bpi nl engⅡlcel Isby们nsfecti onw i th一8一 第二军医大学博士学位论文cel ll i ne i n rel atedstudi es.(i i lt uRN Aby 90%and 88%,respecti vel y, w hi ch approachto the i nhi bi ti veeffeci ency ofsi EG FP( 92%) .In transl ati onl evel ,si 410 and si 312si l ence M cel Aexpressi on by51%and49%,respecti vel y, w hi chare l ow er than the i nhi bi ti veeffeci encyof si EGFP(70%).(i i i )AsW estern bl ot exhi bi ted,tw o cl ose i ntact bands w i th 85 kD a i n M Wpresent target protei ns,of M cel A- EG FP fusi on protei n m i ghtgl ycosyl ati onm odi fi cati on w hi l eexpressedi n H EK293一T cel l s.( i V) Vari ous si RN Astargeti ngthe sal negene getto theequi val enti nhi bi ti veeffeci encyat di fferent ti m epoi nt,w hi chm i ght be rel ated w i th di fferentcuri ng effeci encyofcorrespondi ngRI SCcom pl ex.Thi rdl y, them echani smof M cel Aprotei ni ni nduci ngbacteri al i nvasi on w asexpl ored.O n onehand,si nce w e haveacqui red puri fi edT- M cel Aprotei nand effi ci entsi RN As,i tw as studi ed that T- M cel A' s effectsupontheexpressi onsof TLR- 2 and rel atedsi gnal m ol ecul es i nm acrophagesfromtheobverse( sti m ul ati ng byT-M cel Aprotei nw i thvari ousconcentrati ons)and reverse(si l enci ngof M cel Aexpressi on by si 410)angl es,respecti vel y.O nthe other hand, the recom bi nantM cel A—expressi ngE.col i w as took for thei n vi tro i nvasi onassayi n cul tured RAW 264.7 and CT 26.CL25 cel l s.Resul ts show ed asfol l ow s.(i )The expressi onof TLR- 2 w as enhanced i n RAW 264.7 cel l s sti m ul atedbyT- M cel Aprotei n,fol l ow i ngw hi chexpressi onsof dow nstreamsi gnal m ol ecul es i ncl udi ngIRAK-lsi gni fi cantl y.As know n,acti vati ons of TLR-2,IRAK-1,and TRAF一6 l ead to theacti vati onofN F—KB,oneof nucl ear factors,w hi ch pl ays a centrali nfl am m ati on response.Therefore,the acti vati on functi on of M cel Aprotei n uponTLR- 2m ad even IRAK-1 and TRAF一6 i n RAW 264.7 cel l s.m i ghtbe one ofi m portantfactors i nthe cel l ul ar i nfl am m ati on response i nducedby M tb.( i i ) Therecom bi nantconferred abi l i ti es of i nvasi on and survi valaccom pani edw i th the suffered RAW264.7 and CT 26.CL25pathol ogi cal changes.Especi al l yi n RAW 264.7cel l s,therecom bi nant baci l l i caused thesuffered cel l sbecom i ngl arger,m em braneprotrusi ons,w hi chm eanthecytoskel etal reorgani zati on.So,i ti s concl udedthatE.col i has certai n i nvasi onabi l i tyand canescapethe i m m uneki l l i ngofm acrophages,andthat the m echani smof M cel Aprotei ni ni nduci ngbacteri ali nvasi onm i ghtbe associ ated w i thcytoskel etal reorgani zati ons oftargetcel l s.To sum m ari ze al l the resul ts,i t can be i nferred that M cel Aprotei n m i ghti nduce thei nvasi on,the i m m uneescape,andtheprogressi ontodorm ancyorpathogenesi sofM tb,through acti vati ng TLR- 2 and i ts dow nstreami nfl am m atory si gnalIRAK· 1,and parti ci pati ng,i n regul ati onsaccordi ngto recentreportsabout i nvasi on m echani sm s ofLi steri a,Sal m onel l a,Shi gel l a,Yersi ni a,and M ycobacteri umavi umcom pl ex( M AC) ,w e are l i ke to rai se thepossi bl eIntranscri pti on l evel ,si 410and si 312 earli nhi bi t racel afrom w hi ch w esupposedthatpartbeofspeci fi cand TRAF-6 w ereup-regul atedtoo.w i th IRAK-1’ sexpressi on changedm oreregul ati onrol e i n the cel l ul arE.col i w asi n RAW264.7cel l sforatl east 48h.cel l sexhi bi ti ng som eand show i ngseveralbi ggernucl eiand si gni fi canttheM cel A—expressi ngm ol ecul es i ncl udi ngof hosti nfl am m ati on response.M oreover,一9一 第二军医大学博士学位论文i nvasi on m echani smof M tb as fol l ow s.( i ) Thei nvasi on m echani smof M tbm aybe thesam e to or l i ke that of M AC,the zi pper-tri gger m echani sm .( i i ) nl e regul ati onfuncti on ofM cel A i n host i nfl am m ati onresponses m i ghtbe onei m portanti ni ti al factorcausi ngthezi pper-tri ggerrel atedcytoskel etal reorgani zati on.3.Rapi dcl assi fi cati on and detecti on of m i crobi al 16S rD N Asby FQ - PCRFounded on them ul ti pl e sequence al i gnm entsandphyl ogeneti ctreeanal ysesof 16S( 18- 28S) rD N As of 58 strai ns of bacteri a,Chl anaydi a, m ycopl asm a,and fungi ,thebacteri al uni versal andspeci fi c FQ · PCR pri m ersw eredesi gnedi n thehi gh hom ol ogousandspeci fi c regi ons,respecti vel y.TotalD N As w ere extracted andpuri fi edf romover 20standard orcl i ni cal l y i sol ated strai nsi ncl udi ngPaerugi nosa,&aerus,S ci treus,S typhi ,s.paratyphi ,S fl exneri ,B proteus,S.epi derm i s,s.hom i ni s,S.pneum oni ae,E.col i ,B.anthraci s,M tb,U ureal yti cum ,C al bi cans,and ekrusei .Target fragm entsof bacteri al16S rD N As w eream pl i fi ed byPCR、Ⅳi 血uni versal andspeci fi c pri m ers.respecti vel y, andused to construct recom bi nantpM D l8- Tpl asm i dsas the standards ofFQ —PCR.The20 ulof reacti onsystem sw eredevel opedw i th T擞aRa SYBR@ Prem i x ExTaqTMand U Sed furrapi ddetecti ons of di l uti ongradi entsof vari ous D N Asam pl es by FQ —PCR.Resul ts ofphyl ogeneti ctreeanal yses show edthatl 6S( 18~28S) rDN ACanbechoseasthei deal targetgeneforrapi dcl assi fi cati ons and detecti onsofbacteri a,Chl am ydi a,m ycopl asm a, and fungi .Fi ndi ngsi n FQ - PCR dem onstrated thatrapi ddetecti ons of vari ous bacteri al 16S rD N AsCanbeperform edi nabout 2 hw i th uni versal andspeci fi c pri m ers,andthat the m ethod i s ofgood speci fi ci tyandsensi ti vi ty( about2~5pg/p.1oftotal bacteri alD N A,or2× 10’ ± 3× 102copi esof 1 6S rD N Agene).Keyw ords:M ycobacteri um tubercul osi s( M tb) ;vi rul encegene;i nvasi on;sm al li nterferi ng RN A( si RN A) ;cytoskel etalReal - ti m efl uorescencequanti tati ve PCR( FQ —PCR) ;16S rD N Areorgani zati on;i nfl am m ati onresponse;—10 第二军医大学博士学位论文第一部分M tb毒力基因m cel a的表达特性、克隆及原核表达第一节前言:m cel ag岖l 与m ce基因ggt近年,结核病( tuberci J l osi s,TB) 死恢复燃,已被W H O 列为世界三大传染病之一。在全球,TB有很高的发病率与死亡率,严重威胁着人类健康【I】。在我国,TB( 肺结核) 的发病数及死亡数一直高居近两年全国法定报告传染病的首位,成为影响我国人民健康的头号传染病杀手( 据卫生部每月传染病疫情公告) 。其病原菌为结核分枝杆菌( M ycobacteri umtubercul osi s,M tb) ,该菌抗酸染色及革兰染色均为阳性,属细胞内寄生菌。目前,尽管利福平、异烟肼等一线药物能够有效治疗急性新发病例( 我国:约145万例侔),但难以根治为数众多的慢性及隐性感染者(我国:M tb感染率“ .5%) ;并且,耐药M tb感染同渐增多( 我国:菌阳肺结核病人中耐药者约占1/4) ,卡介苗( M ycobacteri umbovi s baci l l us Cal m ette.Gu6ri n,BCG)的预防作用值得怀疑【2J 。因此,发展新型疫苗及更为敏感有效——尤其是针对慢性及隐性M tb感染——的抗TB药物已迫在眉睫。然而,M tb的具体致病机制目前仍不十分清楚,这为进一步研发更有效的新型预防、诊断及治疗试剂带来了很大障碍。M tb有H 37Rv与H 37Ra两种标准菌株,前者为毒力株而后者为减毒突变株,它们均来源于1934年的人肺H 37分离株pJ 。与一些临床分离株不同的是,H 37Rv对药物敏感、利于基因工程操作并在TB动物模型中保留了完整毒力,因而该菌株被广泛应用于TB相关的生物医药研究(M tb琊7Rvproj ectatSangerIm ti tu把,N CBI)。H37Rv基因组全长441l 532nt,平均G +C含量65%,共含4048个基因,其中有99个基因编码与毒力等相关的产物[4—1。随着现代分子生物学实验技术的应用,M tb毒力和致病性的研究已取得较大进展。利用随机引物差异显示PCR( RN A arbi trari l y-pri m eddi fferenti al di spl ay PCR,RAP—PCR) 、消减杂交( subtracti ve hybri di zati on,Sm 、体内互补( mvi vocom pl em entati on) 以及标签转座子诱变( si gnature-tagged transposonm utagenesi s,STM ) 等方法16】,数十个致病相关基因已被发现:Rv2770c、Rvl 345、Rv0288、Rv2336、Rvl 320c及Rv2819c,M TV041.29、M Tv004.03、M TV028.09、M TCY78.20、M TCY01A6.09及M TCY31.20,如馏、如话、m as、faaD28、furB、groEL-2和rp/E,砌蚵(Rvl 908c)、rpoV(Rv2703)、fadD26(Rv2930)、pksb(Rv0405)、Rvl 395、l i pF( Rv3487c) 、m m pL7( Rv2942) 、Rv2452c、Rv0204、ddrC( Rv2938) 、m m pL2( Rv0507c) 、m odA( Rvl 857) 、m m pL4( Rv0450c) 以及Rv3018c, fadD28( Rv2941) 。尽管如此,上述多数基因的具体功能及毒力表型却并不十分清楚。M tb致病的关键,是其能侵入宿主细胞并长期生存、增殖。因此,对靶细胞具有侵袭性是M tb最为重要的毒力表型之一。近年研究表明,m cel a是决定M tb侵袭性表型的关键基因。Ri l ey小组的Arruda等【7】构建含H 37Ra基因组的重组质粒,转化无致病性的F~col i XLl .Bl ue株,并以转化菌感染H eLa细胞,而后筛选能侵入细胞的重组 第二军医大学博士学位论文E.col i 克隆。结果发现,感染约3.5 h后在电镜下即看到胞内菌,其持续存在可达24h,而且,重组菌能在细胞内增殖;转化DH 5a、H Bl 01及N M 522等非致病的E.col i 菌株也有相似结果,自发缺失该片段的转化菌则丧失了侵袭性。因H eLa细胞不具有主动吞噬异物颗粒的能力,而普通E.col i 也不能主动进入细胞,故转化菌所含M tb的插入序列为其带来了一定的致病性。该序列所含基因即m cel a,全长1584bp( H 37Ra) ,含O RFl ( nt208~m 807) 及O RF2两个读码框,前者含有与细菌黏附、侵入细胞相关的元件,后者则与细菌的胞内生存有关垆J 。图1.M tb黜基因家族结构与分布示意11114,91。Fi g1。The schem ati cdi agramof M tb racegenefam i l i es.pcM AM P:Probabl econserved M ce associ ated m em braneprotei nM tbm cel a基因隶属m ce( m am m al i ancel lentry) 基因家族,后者共含m cel 、m ce2、race3及m ce4四个结构相似的操纵子14J 。其中,m cel 操纵子包括yrbEl a、yrbEl b、m cel a、m cel b、m cel c、m cel d、m cel e( 1prK) 及m cel f( RⅣ0167~RvO l 74) 八个基因,race2、race3及race4三个操纵子则分别包括对应的yrbE( 2/3/4) a、yrbE( 2/3/4)b、race(2/3/4)a、i nce(2/3/4)b、m ce(2/3/4)c、race(2/3/4)d、m ce(2/3,4)e[勿r( L/M /N ) 1及race( 2/3/4) f等八个基因,它们共编码24种M tb的细胞侵袭相关蛋白( 图1) 。Tekai a等[91通过生物信息学研究发现,M ee蛋白质家族中除Lpr(K/L/M /N )之外的20种蛋白质,其Ⅳ末端均存在高度疏水区域( 跨膜i f, 螺旋) 用于穿越脂质双层;Lpr( K/L/M /N ) 四种蛋白质则可能作为脂蛋白前体( 1i poprotei nprecursor) 经成熟后修饰,再通过一种与Ⅳ末端半胱氨酸残基相连的棕榈酸盐组分锚定于细胞膜。Tekai a等191j 丕发现,M ce蛋白质家族的Ⅳ端l ~150残基与E.col i 及流感嗜血杆菌(H aem ophi l usi nfl uenzae)的Ⅳ端膜锚定蛋白YrbD有一定序列相似性(P<O .0001),并且race各操纵子的后六个基因均像YrbD编码基因一样紧随在yrbE之后。 第二军医大学博士学位论文(1)置:量.o名已2k墨、Il IEl a、rbL。Ib^∥ 、肌_m M .。^ ‰‰棚讪、。趴l。n粥AⅥVV。11V。、:⋯\』“’ ∥ ㈧”Am i no aci d num berAm i no aci dnum ber图2.M tbm cel 操纵子各基因编码序列疏水性分析( byD N AM AN ) 。Fi g 2.H ydrophobi ci ty anal ysesof am i no aci ds ofM tbm celoperon byD N AM ANsoftw are.( I) YrbEl a andYrbEl b;( 2) M cel a( H 37Rv, H 37Ra, andBCG ) ,bl ackarrow spoi ntto hi ghl y hydrophobi cregi ons;(3)M cel b~M eel f, regi onsabove bl ack l i nes m ean thehi ghl y hydrophobi cones.我们通过D N AM AN 软件对H 37Rv m cel 操纵子各基因编码产物进行了疏水性序列分析,结果显示:YrbEl A和YrbEl B主要由疏水性( 非极性) 氨基酸构成,M cel A( H 37Rv、H 37Ra或BCG ) 及M cel B~M cel F的Ⅳ端均含有一段疏水性序列( 图2) ,推测可能是信号肽序列。上述资料均提示,yrbEl a和yrbEl b的编码产物可能为含六个跨膜旺螺旋的完整膜蛋白【9],m cel a一-.m cel f的编码产物极有可能由其信号序列引导 第二军医大学博士学位论文而在细菌表面表达。2001年,Ri l ey小组的Chi tal e等nol 通过胶体金免疫电镜技术,证实M cel A蛋白表达在M tb表面。2003年,D as等⋯ j 预测了的M cel A蛋白的分子结构( 12个螺旋9个片层及1个转角) ,同时提出,该蛋白一个60m et的肽表位与促进细菌进入哺乳动物细胞有关。在M tb H 37Rv( G enBank no.△ △ :=Q Q 旦』2互2)、H37Ra(GenBank ri o.:a2Q 皇Q 』)及BCG( G enBankno.4旦』£! 鲤) 基因组中,m cel a的编码产物( M cel A蛋白) 均与细菌侵袭及在巨噬细胞内生存相关。继Arruda等【7】通过( 正向) 体内互补技术最早发现m cel a与侵袭相关之后,研究者又以同源重组( 等位基因交换) 技术对该基因的功能进行了反向遗传学分析。1999年,Fl esseU es等[ 121通过同源重组产生一个m cel a基因被破坏的BCG 突变株( BCG m ce一) ,结果发现,相对于野生株而言,该突变株对H eLa细胞的侵袭力下降了45%。2003年,Ri l ey小组的Shi m ono等【l3J 通过同源重组破坏M tbErdm an株和BCG 株的m cel a基因后发现,产生的两个突变株均具有“ 超毒力” :( i )突变株较野生株能更快的在BALB/c小鼠体内增殖并杀死小鼠:( i i ) 在组织水平( 感染16~32周) ,突变株感染的小鼠肺部组织出现弥散分布的肉芽肿,而野生株则导致了相对局限的结节;( i i i ) 在细胞水平( 感染12~16周) ,突变株较野生株引起更轻微且更弥散的淋巴细胞浸润。由此,“ 正向” 及“ 反向” 研究的诸多证据表明,m cel a基因在M tb对宿主细胞的黏附、侵袭,乃至在宿主体内的长期潜伏生存等关键致病环节中,均发挥有极为重要的作用。 第二军医大学博士学位论文第二节毒力基因m cel a在M tb潜伏生存与活性增殖状态下的表达特性M tb属专性需氧细胞内寄生菌,感染后能在宿主体内以休眠状态( state ofdorm ancy) 长期潜伏生存,并在一定条件下复苏、大量增殖从而引发疾病Il ⋯ 。M tb在潜伏过程中,休眠菌必须适应细胞内恶劣的生存环境,保护利于其生存的特定小生境(aspeci fi c ni che) ,并采用多种机制逃避宿主的免疫杀伤[ 15,” 】,这种适应性改变则与一些关键基因的表达调控密切相关u7.18] o因此,研究重要的毒力基因在M tb活性增殖及潜伏生存状态下的表达变化,对于揭示毒力基因功能与相关致病机制均有重要意义。根据G reenw ood等主编的( ( M edi cal M i crobi ol ogy( 15山edi ti on) 》1191,M tb在低于25℃将停止生长,故低温( 4℃) 条件下长时间存活的M tb菌株可以作为一种非增殖状态的体外模型。在本研究中,我们选取两株M tb标准菌株( H 37Rv和H 37Ra) 及八株临床分离株,分别以4℃保存3 111与37℃培养2 w ~5 W 为其非增殖状态和活性增殖状态,以看家基因16S rRN A为内参照,通过R1二PCR的方法对m cel a基因的表达特性进行了检测与分析。l 材料与方法i .1材料1.1.1菌株与培养基M tb标准菌株H 37Rv( 4兀℃2刀舛) 和H 37Ra( 彳丁Cc 35835) 由解放军309医院结核病研究室庄玉辉教授惠赠:8株临床分离株来自安徽省结核病防治研究所( 本室潘卫教授保存) ,其中非耐药株4株( 编号为N o.209、N o.565、N o.400和N o.554) ,耐利福平和异烟肼株各2株( 编号分别为N o.397和N o.682,N o.545和N o.683) 。改良罗氏斜面培养基购自上海市临床检验中心。1.1.2主要试剂焦碳酸二乙酯( DEPC) 购自华美生物工程公司,RN ase.freeDN aseM i x及M —M LV逆转录酶购为Prom ega产品,TaqDN A多聚酶购自上海博彩生物科技有限公司,dN TPM i x( dATP、dG TP、dCTPdTTP各0.2m M ) 为Sangon产品。1.1.3主要仪器N uai re7M ( ⅣDⅣu425—400E) Cl assH 生物安全柜,PTC.100州Program m abl eControl l er自动PCR仪( M J Research,Inc)。1.2方法1.2.1获取细菌样品 第二军医大学博士学位论文在生物安全柜内,从4℃保存3 m 的10株M tb标准及临床菌株,分别挑取数个菌落( 约40rag) 作为非增殖状态M tb样品;另外,分别挑取单菌落接种罗氏斜面培养基,置37℃孵箱培养。2 W 后,各培养管可见大量灰白色菜花样菌落,分别挑取数菌落作为2 w 活性增殖状态M tb样品;管内余菌继续置37℃孵箱培养至3 w ~5 W 时,挑取相应培养时段的菌落,分别作为3W 、4W 及5W 活性增殖样品。1.2.2细菌总RN A的提取与纯化以0.5%w /vTw een80洗涤细菌2次【20】,低温高速离心( 15 000rpm ,30S,4℃),并将沉淀重悬于200一不含gN ase的ddH 20( 含0.1%D EPC) 。加溶菌酶至终浓度为5m g/m l ,置37℃水浴30rai n;加蛋白酶K( 终浓度0.2m g/m 1) 和l %w /vSDS,置65℃水浴30 m i n。之后,依次以等体积的酚/氯仿/异戊醇( 25:24:1) 和氯仿/异戊醇( 24:1) 抽提,上层水相以10U RN ase.freeDN aseM i x消化去除DN A( 37℃,1 h),再以等体积的酚,氯仿/异戊醇( 25:24:1) 和氯仿/异戊醇( 24:1) 各抽提一次。水相所含的RN A经2倍体积无水乙醇( 含1/10体积3M 乙酸钠pH 5.2) 沉淀( 一20℃,l h)及75%v,v乙醇( 0.1%DEPC水配制) 洗涤后,干燥后溶于50山DEPC水中12“ 。分别取各RN A样品8山,以含2.2 M 甲醛的0.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定[ 221,并以分光光度计测浓度与纯度,置一70℃备用。1.23引物设计与合成以D N AM AN 软件对m cel a基因进行酶切位点分析及引物设计。为便于后续克隆研究,m cel a上下游引物分别加上H /ndl II和Sa/I酶切位点( 下划线部分) ,其序列为5’ 一△ △ 鱼£! ] 了GTAGCcGCATGACG一3’ 和5’ · Q 里£鱼鱼&CATGGGTTGATCG-3’ 。rRN A的引物参照文献117】,序列为5’ .TTG ACG G rI’ AG G TG G AG AAG AAG C.3’ ( nt469~nt491) 和5' -CcTTTG AG TTTTAG CCTTG CG G .3’PCR扩增,预期靶片断大小分别为1385bp( racel a) 和441 bp( 16SrRN A) 。引物由Sangon公司化学合成。16S( nt909~nt888) 。以上述引物进行1.2.4两步法RT-PCR首先,以m cel a或16S rRN A特异性下游引物进行逆转录反应( reversetranscri pti on,RT),合成eDN A第一链。取3“ l (1.0岫RN A模板与1肛l 特异性下游引物( 30斗M ) 混匀,置70℃水浴5m i n,立即冰浴30s,低速离心收集;加5m5xM - M LV缓冲液、1山dN TPM i x、O .5IxlRN asi n( 40U/rtl )、1“ l M .M LV逆转录酶及13.5IxlD EPC水( 总体系25“ 1) ,混匀后置42℃水浴l h进行逆转录反应,随后于95℃5 m i n灭活M .M LV酶,并立即将RT产物置冰浴备用。其次,以RT产生的ssD N A为模板进行PCR扩增反应。反应体系( 5091) :10× Taq酶缓冲液5山,dN TPM i x1肛l ,上游及下游引物各1肛l ,2.5 U/l al Taq酶0.5¨ l ,ssDN A模板5¨ l ,DEPC水36.5山。反应条件:95℃预变性5 m i n;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸50s,30个循环;72℃延伸5 m i n,4℃保温5 m i n。设立如下对照:细菌总RN A作为模板阴性对照,以检测是否污染基因组D N A;16S rRN A作为平行—16 箜三兰墨垄堂堡主兰堡笙查检测的阳性内参照基因。图1.十株M tb菌株总RN A提取物的甲醛变性凝胶电泳分析( EB染色) .Fi g1.Ethi di umbrom i de stai neddenaturi ngf orm al dehyde gel el ectrophoresi softotalRN Apreparati onsf romt enM tb strai ns.Lanes 1 and 2,the standard H 37Rv and H 37Rastrai ns;l anes3 to 10,the 8 cl i ni cal i sol ated M tbstrai ns w i ththe num bers bei ng 209,565,400,554,397,682,545,and683,respecti vel y M ,theD N Am arker.Threebl ackarrow s poi nttothe23S,16S,and 5SrRN A,respecti vel y.图2.M cel a基因在M tb静止生长期的表达情况( RT-PCR检测) .Fi g2.The m cel aexpressi on profi l eofM tb i n thestati onary grow th phase byRT- PCI LA.Lanes 1/3,H37Rv;l anes 2/4,H 37Ra.B.Lal i e 1,the tem pl atecontrol w i th total RN Aas theanycontam i natedgenom i c DN A;l anes 2/3,4/5,6/7,and8/9 are M thstrai nsN o.209,N o.565,N oA00,and N o.554,respecti vel y.C.Lane l ,tem pl ate control ;l anes 2/3,4/5,6/7,and 8/9 are M tb strai ns N o.397,N o.682,N o.545,and N o.683,respecti vel y M ,the D N Am arkeL Bl ack arrow spoi ntto thetarget bands( 441bp) of16SrRN A,the i nternal conl rolgene,andthe other bands arenonspeci fi cones.In thi sassay, expressi onof m cel agene( 1385bp) hasnotbeen detected.PCRtem pl ateto detect—d7一 第二军医大学博士学位论文2结果2.1细菌总RN A琼脂糖电泳鉴定对各细菌样品总RN A,以0.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。结果显示,通过本研究采用的细菌裂解与RN A提取方法,对2株M tb标准菌株及8株M tb临床分离菌株,均获得了完整的细菌总RN A( 23S、16S及5S rRN A) ,且未见残留的基因组D N A( 图1) 。2.2 M tb静止生长期m cel a基因的表达为检测m cel a基因在M tb静止生长期的表达特性,对4℃保存3 In( 仍存活,可复苏) 的10株M tb菌株分别提取总RN A,并以RN ase.free DN aseI消化去除DN A。经两步法RT-PCR检测,结果显示,racel a基因在10株静止期M tb菌株均未见表达,而作为内参照基因同时检测的16S rRN A表达水平基本一致( 图2) 。图3.M eel a基因在M tb活性增殖期的表达情况( RT-PCR检测) .Fi g3.The m cel aexpressi on profi l eofM tb i n the acti vegrow th phase byRT- PCR.A.Lanegenom i c D N A;l anes 2/3 and 4/5,cul turedH 37Rv for 2wand4w ;l anes 6/7 and 8/9,cul tured H 37Rafor 2wand 4w .B.Lane 1,tem pl ate control ;l anes 2/3,4/5,6/7,and8/9N o.400,N o.397,and N o.683 for3w , respecti vel y.C.Lane l ,tem pl atecontrol ;l anes 2/3,4/5,6/7,and8/9 are are cul turedM tb strai nsN o.209,N o.400,N o.397,andN o.683 for 5w , respecti vel y.M ,theD N A1,the tem pl ate controlw i th total RN A asthe PCRtem pl ateto detectanycontam i natedare cul tured strai nsN o.209,m arker.Bi gbl ack arrow spoi ntpoi nti ngto 16S删Abands(441bp),andthe other bands arenonspeei fi cones orpri m erdi m ers.totarget bands( 1385bp) ofm eel agene,w i thsm al lbl ack arrow s2.3 M tb活性增殖状态下m cel a基因的表达为检测m cel a基因在M tb活性增殖状态下的表达特性,对37℃培养2w ~5 w 的10株M tb菌株分别提取总RN A,进行RT-PCR检测。结果显示,m cel a基因在10株活性增殖期M tb菌株均见稳定表达,同时检测的内参照基因16S rRN A表达水平也基 第二军医大学博士学位论文1.2.2引物设计与合成因M tb基因组特点( 平均G +c含量达65.6%,各基因序列同源性较高) 【4J ,以普通PcR通常难以实现目的基因的高效率、高特异性扩增,故采用巢式PCR方法,通过外、内两对引物( Exo_pri m er及In-pri m er) 对全长晰cPl a基因进行扩增( 预期大小1385bp)。合成(sangon)的引物序列如表l 所示。其中,Exo-pri m er涵盖了肿E1b( 位于删cPl a基因上游) 和小fPl b基因( 位于m cPl a基因下游) 的部分序列;In.pri m er的上、下游引物分别加有脚耐Ⅲ和勋,I酶切位点( 下划线部分) 。全长聊卯1a基因的5’ 端含疏水信号序列,为同时比较该基因截短的活性产物的生物学功能,设计、合成另一对内引物( In—pri m er2) ,用来扩增ⅢcPl a基因的活性区段B肌cel a( truncatedm cPl a) ( 预期大小650bp)。In.埘m er2的上、下游引物分别加有砌RI和删I酶切位点( 下划线部分) 。表1.用于巢式PcR扩增删∞1a和T-ⅢP1a基因的引物序列.Tab1.Pri m e髓used i ntheⅡ船t-PCRof埘cPl a aⅡdT吨恍1agenes.ⅣDfe:The underl i ned nucl eoti dcs i n form er and reverse s仃andofIn.pri m er m eant}l ei nseneden巧m e exci si on si teof埘耐IⅡand&“ ,respecti vel y.Theunderl i nednucl eO ti des i n f0肿er and revcrse st瑚d0fIn· pri m er2 m eantIl e i Il serteden2ym eexci si O n si te of E∞R I and Sh儿,rcspec石Vel y.1 2-3nest。PcR与D N A测序外引物PcR以H 37Rv基因组D N A为模板,对含脚∞1a、部分∥ 6E和埘cFl b基因的大片段进行扩增。反应条件:95℃预变性5m i n;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸50 s,30个循环;72℃延伸5 Ini n。之后,在同样程序下,取l 肛l 外引物PCR产物作模板,以In-pri m cr或In.pri m er2为内引物进行PCR,分别扩增全长埘fPl a及截短的T-聊cPl a基因。对扩增终产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳分析,回收、纯化目的片段并将其连入pM Dl 8.T载体。分别将pM D—m cel a和pM D一.I~m cel a两种重组质粒转化Ec棚DH 5a菌,挑单克隆菌落进行质粒抽提、酶切电泳鉴定及DN A测序( Sangon) 。1.2.4质粒构建与转化全长m cel a及T- 玳cPl a基因经D N A测序证实后,为转换接头,从重组质粒—2l 一 第二军医大学博士学位论文D M D .m cel a上切下m cel a片段( H i ndl II/Sal I) 并将其插入载体pEG FP—N 1,得到D EG FPN l 一m cel a( 用于论文第二部分的RN Ai 研究) 。双酶切( xhoI/l epnI)pEO FPN l .m cel a质粒,将所得目的片段插入原核表达质粒pRO EX.H Tb,得到重组质粒pRO EX,m cel a。同时,从pM D.Tm cel a上切下T-m cel a片段( EcoRI/Sal I)并将其插入载体口BV220,得到重组质粒pBV-Tm cel a( 图1) 。将pRO EX-m cel a和pBV-Tm eel a质粒分别转化DH 5a菌,获得相应转化菌。Resl - PCRnest—PCR2二二二二]■ 【二二pM D - m cel aM 删刚l二二二】【二二pBV- Tm cel a二==二● 【二二二pRO EX- m cel a图1.重组质粒pRO EX-m cel a和pBV-Tm eel a的构建示意图.Fi g1.The schem ati cdi agramof constructi ons of recom bi nant pRO EX- m cel aandpBV- Tm ecl a pl asm i ds.N ote:ThepEG FPN l 一m eel apl asm i di s constructed for future use i n RN Aisecondpartofthi spaper.studi es ofthe覃茎一笛}钋三一E暑一 三匐 第二军医大学博士学位论文1.2.5Ecol i 诱导表达分别挑取pRO EX—m cel a和pBV- Tm cel a转化菌及pRO EX—H Tb和PBV220空质粒转化菌( 对照菌) 的单菌落,接种2m lLB培养基( Am p,100 l ag/m 1) ,37℃振荡培养过夜。次日,转接0.1 m 1培养物至10 m l LB培养基( Am p,100 p。g/m 1) ,37℃振荡培养。当O D 600值达O .8--1.0时,取1 m l 菌液收集沉淀并用80 gl PBS重悬,此即未诱导样品。对pRO EX—m cel a转化菌,在剩余培养物中加入IPTG ( 终浓度0.6m M ) ,37℃下诱导培养;对pBV-Tm cel a转化菌,进行42℃热诱导。分别在诱导1h、2 h和3 h时,各取1 m l 菌液收集沉淀并以80“ l PBS重悬,作为诱导样品。分别取20¨ l 上述不同样品,加5¨ l 5× SD S上样缓冲液( 100m M Tri s.H Cl pH 6.8,200m MD TT,4%w /v SDS,0.2%w /v溴酚蓝,20%v/v甘油) 混匀,煮沸10 m i n后冻存于一20℃备用。为进一步研究M cel A蛋白的表达特点,将诱导后的细菌沉淀通过超声破碎( 400W ,3 s× 4sx99× 3次) ,对超声裂解产物以Tri tonX.100( 10%) 处理,并将上清及沉淀进行SDS—PAG E分析。图2.M tb基因组DN A、基因扩增产物及重组质粒酶切的琼脂糖电泳鉴定.Fi g2.Theagarose gel el ectrophoresesofM tbgenom i c DN A,am pl i fi cati on productsof m cel a andT- m cel agenes,and di gesti on productsof recom bi nantpM D - m cel aand pM D - Tm cel apl asm i ds.A,M tb genom i cD N A extracti onanal yzed by O .5%gel .B,the am pl i fi cati on productofm cel a( 1) anddi gesti on productproductofT-m ceIa( 1) and di gesti on productof recom bi nant pM D - Tm cel a pl asm i d( 2) anal yzed by1.2%gel .M ,theD N Am arker.D i fferent bl ackarrow spoi ntto rel atedtarget bands,respecti vel y.of recom bi nantpM D - m cel a pl asm i d( 2) anal yzed by 1.2%gel .C,the am pl i fi cati on 第二军医大学博士学位论文1.2.6表达产物的N i .N TA柱纯化或包涵体纯化对pRO EX—m cel a转化菌,进行100m l 规模诱导表达( IPTG0.6 m M ,37℃诱导3 h) :并以N i .N TA柱纯化法对重组菌表达产物进行纯化,方法如下。①重悬:以lm l Buffer B( 8 M 尿素,0.1 MN aH 2P04,0.01MTri s—H Cl ,pH 8.0) 重悬沉淀,室温静置15 rai n;②裂解:室温下搅拌或轻轻振荡1 h( 避免产生泡沫) ;③离心:室温下将裂解物离心( 15000 rpm ,30 rai n) ,收集上清;④平衡:加600 l al Buffer B至N i .N TA柱,室温下将柱子开盖离心( 2000 rpm ,2m i n;务必兰2000 rpm ) ;⑤加样:取600 p.1裂解上清加至N i —N TA柱,离心( 2000 rpm ,2rai n) 并收集穿流液( thefl ow .through) ;⑥洗涤:以6009l Bufferc( 8M 尿素,0.1M N aH 2P04,0.01M Tri s.H CI,pH 6‘ 3) 洗涤N i .N TA柱,离心( 2000 rpm ,2 m i n) ,再重复洗涤1~2次,留少量洗涤液( thew ash) 备用:⑦洗脱:以200l al Bul yerE( 8M 尿素,0.1M N aH 2P04,O .叭M 强s—HCl ,pH4.5)洗脱目的蛋白,离心(2000 rpm ,2m i n) ,收集洗脱液( theel uate),再同样洗脱l ~2次,目的蛋白即在洗脱液中。对pBV-Tm cel a转化菌,进行200m l 规模诱导表达( 42℃诱导3 h) ;并采用包涵体纯化法,方法如下【...

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